Il rejoindra ensuite l'Akatsuki (organisation criminelle de puissants ninjas de rang S). Pour le compte de cette organisation, il recherche Naruto pour lui extraire
Kyûbi, le démon-renard à neuf queues scellé dans son corps (il recherche aussi les huit autres démons). Le mystère sur le fait qu'Itachi ait épargné son frère demeure durant une grande partie de l'histoire. Dans l'Akatsuki, Itachi fait équipe avec Kisame Hoshigaki. Itachi est à l'origine de l'association de Deidara avec l'Akatsuki. Itachi provoquera aussi le départ d'Orochimaru, ayant vaincu celui-ci grâce à son Sharingan. Orochimaru quittera l'Akatsuki pour se mettre à la recherche du Sharingan et détruire l'organisation. On note au fil des chapitres que sa dévotion envers l'Akatsuki est sans faille. Itachi reste un personnage dont les motivations se dévoilent au compte-goutte. Après la mort d'Itachi, on apprendra que celui-ci n'avait aucune confiance en Madara et qu'il a intégré l'Akatsuki entre autres pour surveiller les actions de Madara et protéger Sasuke de ce dernier.